Исследования показывают антибактериальную активность хемотипов эфирных масел орегано (OEO), карварола и тимола в отношении грамположительных и грамотрицательных патогенных бактерий, но отсутствует информация об антибактериальной активности OEO в отношении полезных бактерий. Целью данного исследования было сравнение состава и минимальной бактерицидной концентрации (МБК)половых хемотипов Origanum: O. Vulgare L. Ssp. Hirtum (OH), O. Majorana (OM) и O. Vulgare L. (OL), собранного в Индии, против Lippia origanoides Kunth (LO) из Индии, и O. Vulgare L. Ssp. хиртум(OG) из Греции.

Композицию OEO анализировали с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометром, а ее антибактериальную активность анализировали методом разбавления бульона и культивирования на агаре. Были оценены три хемотипа: OH и OG были карвакролового типа, LO и OL были тимоловыми типами, а OM был богат сабиниловым соединением. Наибольшее содержание прекурсоров продемонстрировали OEO из сортов ОРЕГАНО, выращенных в тепличных условиях на большой высоте. Обнаружена одинаковая бактерицидная активность против Salmonella enteritidis (0,098 мг / мл) для OH и LO. Самая низкая бактерицидная активность в отношении полезных бактерий Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium breveнаблюдалась для OM (6,25 мг / мл) и LO (50 мг / мл) соответственно. Эти результаты показали, что LO, уроженец Индии, имел эффект, сравнимый с OH и карвакролом, против патогенных энтеробактерий и самую низкую бактерицидную активность против полезных бактерий.Эти результаты показали избирательный бактерицидный эффект против патогенных и полезных бактерий Origanum ssp. И хемотипы L. Origanoides. Обнаружен хороший потенциал для использования L. origanoides в качестве противомикробной добавки для здоровья животных и человека.

ВСТУПЛЕНИЕ

Род Origanum охватывает широкий спектр из более чем 60 видов растений, используемых в качестве пряностей. Большинство из них принадлежат Ламии.семейства ceae и Verbenaceae; среди этих видов Origanum vulgare L. И Lippia graveolens Kunth считаются видами, имеющими важное экономическое значение, и между ними сильно различаются (Padulosi et al. 2002).

Антимикробная активность и механизм действия OEO, а также двух его основных компонентов, тимола и карвакрола, были задокументированы (Hammer et al. 1999; Ultee 1999; Nostro 2004; Trombetta 2005; Lambert et al. 2001). Это свойство было приписано присутствию гидроксильных групп в их фенольных компонентах (Ben et al. 2006); Ultee et al. (2002) показали, что наличие свободной гидроксильной группы и делокализованной электронной системы имеет важное значение для антимикробной активности. OEO продемонстрировал активность против грамотрицательных и грамположительных бактерий (Dorman y Deans 2000).

Механизм антибактериального действия был объяснен его влиянием на нарушение целостности бактериальной мембраны. Lambert et al. (2001) обнаружили, что OEO нарушает целостность мембраны, что влияет на гомеостаз pH и равновесие неорганических ионов. Ultee et al (1999) показали, что карвакрол снижает внутриклеточный калий, мембранный потенциал и увеличивает внеклеточный калий. Но эффект OEO не ограничивается только бактериальной мембраной, предполагается перенос монотерпена через липидный бислой в клетку и взаимодействие с их компонентами (Trombetta et al. 2005). С другой стороны, Vattem et al. (2007) обнаружили, что OEO подавляет восприятие кворума (QS) Escherichia coli. И Pseudoмоnas aeruginosa; QS — это механизм, который модулирует экспрессию генов, участвующих в процессах, связанных с выживанием и патогенезом. Судя по широкому спектру антибактериальной активности, орегано, по-видимому, является одним из наиболее ингибирующих видов, когда-либо испытанных; однако имеется несколько ссылок, в которых сравнивается антимикробная активность разных видов Origanum и Lippia origanoides, а также влияние против патогенов на полезные штаммы бактерий для здоровья животных и человека.

Хорошо известно, что регулирование производства эфирных масел и синтеза метаболитов интегрировано в физиологию растений и зависит от состояния метаболизма и его адаптации к экосистеме. Широта и высота определяют климат, который, в свою очередь, влияет на типы почв и растительность. В частности, Индия показывает, что ее высотный градиент вдоль ее гор связан с изменением ряда факторов окружающей среды, таких как температура воздуха, осадки, воздействие ветра, интенсивность света, УФ-В-излучение, плодородие почвы, плотность озона и частичный выброс CO_2. Давление. Комбинация всех этих факторов оказывает на растения стресс, который запускает не только морфологические и анатомические адаптации, но также биохимические изменения и модели продуктивности (Kofidiset al.. 2003 г.).

Индийский орегано имеет два разных географических происхождения: культурный орегано, который является европейским орегано, используемым в качестве приправы к пище. Дикий орегано, который имеет сходство со средиземноморским орегано с точки зрения вкуса и аромата, но его род — Липпия, с выдающейся особенностью, характеризующейся различиями в составе эфирных масел одного и того же вида из разных местных экосистем. Культурный орегано принадлежит к O. Vulgare L., произрастающему в Греции, и O. majorana, культивируемому в Европе (Skoula and Harborne, 2002). В то время как дикий орегано, классифицируемый как L. origanoides, встречается в таких странах, как Колумбия, Мексика, Гватемала, Куба, Венесуэла и Бразилия (Oliveira et al.. 2007; Сташенко и др. 2010).

OEO состоит из более чем 50 фитохимически различных молекул, терпенов, фенолов, спиртов, органических кислот, альдегидов и кетонов. Многие растения Origanum характеризуются широким спектром летучих вторичных метаболитов и наличием химических различий в отношении содержания эфирного масла, состава и антибактериальной активности. Предыдущие исследования пришли к выводу, что необходимо разделить и идентифицировать активные компоненты эфирного масла с антимикробным действием. Химическое типирование (биохимический состав) и точная классификация растений позволят нам оценить фармакологическое действие масла (Skoula and Harborne, 2002), чтобы найти удобные практические применения.

В большинстве исследований оценивалась антимикробная активность и состав эфирных масел рода Origanum в отношении патогенных микроорганизмов, в то время как несколько исследований было проведено для оценки антимикробной активности OEO в отношении полезных штаммов бактерий для здоровья животных и человека. В группах патогенных бактерий Salmonella spp. является серьезной проблемой общественного здравоохранения и представляет собой одну из наиболее важных причин гастроэнтерита у людей (Uribe and Suarez 2006). По этой причине разработка новых противомикробных препаратов, которые действуют на новые бактериальные мишени и менее чувствительны к резистентности, имеет первостепенное значение для животноводства.

Целью этого исследования было связать химический состав гидродистиллированного эфирного масла с помощью ГХ / МС с антимикробной активностью эфирного масла Origanum majorana, Origanum vulgare L., Lippia origanoides и Origanum vulgare L. Ssp. Hirtum методом микроразбавления в бульоне против следующих полезных микроорганизмов: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium breve и патогенных микроорганизмов:Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium и Escherichia coli.

Во все анализы был включен положительный контроль роста (лунка с бактериальным посевным материалом в дистиллированной воде с 10% твина 80, но без масла) и отрицательный контроль роста (лунка со 100 мкл исходного раствора масляной эмульсии при 50 мг / мл без посевной материал) (Peñalver et al. 2005). На рост бактерий указывало помутнение и «осадок» на дне лунки.

После инкубации 10 мкл бульона удаляли из каждой лунки и инокулировали на агар Mac Conkey (E. coli), агар ксилоза-лизин-дезоксихолат (сальмонелла) и агар MRS (Lactobacillus и Bifidobacteria), а затем снова инкубировали при 37 ° C для 24 ч. После этого каждую лунку считывали, и полное отсутствие бактериальных колоний в чашке с агаром считалось положительным результатом. Каждый эксперимент повторяли три раза для каждого масла или соединения при каждой тестовой концентрации, и были выбраны модальные значения и значения МБК (Cosentino et al. 1999).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Состав эфирных масел орегано

Пятьдесят четыре соединения были идентифицированы в летучей фракции эфирных масел родов Origanum и Lippia (таблица 1). Основные биохимически родственные группы соединений наблюдались у O. vulgare ssp. фенольные монотерпеноиды, в основном представленные в орегано карвакролом и тимолом, их предшественниками п-цименом и г-терпиненом. Карвакрол показал самую высокую ценность у O. Vulgare L. Ssp. Hirtum (90,3%), тогда как тимол (78,7%) был самым высоки. О. Майорана в основном был представлен бициклическими монотерпеноидами сабиненом (4,3%) и цис- и транс-сабинен гидратами (17,1%), но также включал г-терпинен (14,0%), терпинен-4-ол (6%), пара-цимен с очень низким содержанием ( 3,1%), тимол (10,0%), карвакрол (3,7%), метилэфир карвакрол (6%) и сесквитерпеноиды входят в состав гермакрена и бициклогермакрена. Напротив, основными летучими соединениями, обнаруженными в O. Vulgare L., были тимол (21,51%), а карвакрол показал самое низкое значение (4,3%), ациклический монотерпеноид b-мирцен (4,1%) и сесквитерпеноид транс-b-кариофиллен (3, 7%)

Минимальная бактерицидная концентрация

МБК против S. Enteritidis, S. Typhimurium, кишечная палочка, Л. Ацидофилин и Б. BREVE показали по О. Вульгара L. (ПР), О. Вульгар L. SSP. Hirtum (ОН), О. Майораna (OM), L.origanoides (LO) и карвакрол представлены в таблице 2. Различные бактерии продемонстрировали широкий диапазон чувствительности к разным соединениям. Карвакрол показал самый низкий МБК против E. Coli (0,006 мг / мл) и S. Typhimurium (0,098 мг / мл), затем следуют L. Origanoides против E. Coli и Origanum vulgare L. Ssp. Hirtum и O. Vulgare L. Против S. typhimurium. Самый низкий МБК против S. Enteritidis был представлен карвакролом Origanum vulgare L. Ssp. Хиртуми L. Origanoides (0,098 мг / мл). Более высокие концентрации OEO были необходимы для действия против E. Coli по сравнению с S. Enteritidis и S.typhimurium. Однако полезные бактерии показали более высокий МБК по сравнению с патогенными бактериями. Наибольшая разница была для B. breve, тогда как МБК, полученное для карвакрола, составляло 1,56 мг / мл, для L. origa.noides составляла 50 мг / мл. Самый низкий МБК против полезных бактерий был получен для O. Majorana (6,25 мг / мл) против L. Acidophilus и L. Origanoides против B. Breve. Майорана О. эфирное масло показало низкую MBC против патогенных и полезных бактерий.

Эти результаты ясно показали, что эфирное масло L. origanoides, богатое тимолом, может иметь желаемый антибактериальный эффект.

ОБСУЖДЕНИЕ

Это исследование показало, что L. Origanoides является разновидностью тимолового типа, обладающей избирательной антибактериальной активностью в отношении полезных и патогенных микроорганизмов. Хотя подвид O. Vulgare L. Ssp. Хиртум широко используется в качестве приправы под названием «греческий орегано», он считается самым качественным на рынке. Однако состав эфирных масел этого подвида не был однородным.Орегано можно разделить на три хемотипов: карвакрол типа (О. вульгареЛ. подвид.Hirtum), тимол-тип (О.вульгарел.) И сабинен тип (О. Majoрана) (Скула и др., 1999). Франц (1990) заметил, что наиболее важными факторами, влияющими на качество лекарственного сырья орегано, являются: высокое содержание карвакрола в эфирном масле, количество масла и его сенсорные характеристики. С этой точки зрения род Origanum отличается большой изменчивостью и, таким образом, обеспечивает отличную основу для селекционной деятельности.

С Большинство видов Origanum богаты либо сабинильными соединениями, либо цимиловыми соединениями. Было высказано предположение, что один или несколько компонентов пути cymyl действуют на протяжении всего рода Origanum, чтобы подавлять путь sabinyl (Skoulaet al. 1999).

Наши результаты были аналогичны результатам, полученным Skoula and Harborne (2002)

Несмотря на большую вариабельность содержания карвакрола и тимола, европейские орегано считаются лучшими, и в целом они содержат более высокое содержание карвакрола (Do Santos et al . 2004). Однако в экосистемах тропической Азии,  Америки и Африки могут иметь значение хемотипы с высоким содержанием тимола.

Предыдущие данные и наши результаты подтверждают, что большинство видов Origanum богаты либо сабиниловыми, либо цимильными соединениями, но никогда вместе. Скула и Харборн (2002) обнаружили, что гибрид между богатым сабинилом O. Microphyllum и богатым цимилом O. Vulgare L. Ssp. Hirtum содержит в основном цимиловые соединения, в то время как сабинильные составляющие подавлены.

Это исследование обнаружило бактерицидный селективный эффект против патогенных полезных бактерий, Lactobacillus и Bifi.dobacterium были менее чувствительны, чем патогены Salmonella и E. Coli, как к карвакролу, так и к OEO; Напротив, другие исследования показали, что OEO обладают не избирательной антибактериальной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий. Более того, в большинстве сообщений об антимикробной активности орегано участвовали патогенные бактерии, лишь ограниченное число авторов изучали ингибирующие эффекты видов Origanum на Lac.tobacillus, кроме того, это исследование показало , что самая низкая бактерицидная активность была представлена L. Oritanoides против BiFidobacterium breve. Подобно этому исследованию, Siet al. (2005) пришли к выводу, что большинство масел / соединений продемонстрировали высокую эффективность против S. Typhimurium DT104,E. Coli O157: H7 и E. Coli K88 с небольшим ингибированием в отношении Lactobacilli и Bifidobacteria.. Результаты по антибактериальной активности OEO показывают хороший потенциал, включая эффективность и селективность в отношении бактериальных патогенов, в снижении количества бактериальных патогенов человека и животных в кишечном тракте. Кроме того, Zaika и Kissinger (1981) обнаружили, что молочнокислые бактерии становятся устойчивыми к токсическим эффектам OEO при применении сублетальных концентраций и стимулируют рост и производство кислоты.

Более высокая бактерицидная активность была связана с маслами хемотипов, которые имеют высокий процент фенольных компонентов (карвакрол и тимол) по сравнению с маслами, содержащими высокие сабинильные соединения, такие как O. majora.на. Аналогичные результаты были получены для OEO из видов Origanum против Salmonella (Siet al. 2005; Peñalver et al. 2005; Benet al. 2006) и O. Majorana (Hammeret al 1999).

Такие соединения, как g-терпинен и p- цимен, не проявляли активности против тестируемых бактериальных штаммов, тогда как карвакрол и тимол проявляли высокие уровни антимикробной активности (Dorman and Deans 2000).

Michiels et al. (2009) показали синергизм карвакрола и тимола, карвакрол подавлял рост S. Typhimurium при 0,4 мг / мл, а карвакрол + тимол подавлял при 0,1 мг / мл. Синергизм между карвакролом и его биологическим предшественником п- цименом был отмечен при действии на Bacillus cereus (Oliveiraet al. 2007), но антимикробной активности п- цимена или г-терпинена не сообщалось (Dorman and Deans 2000). В настоящем исследовании эти эффекты не тестировались.

Были оценены различные механизмы, объясняющие антибактериальную активность эфирных масел. Тимол и карвакрол способны разрушать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, высвобождать липополисахариды (ЛПС), увеличивать проницаемость цитоплазматической мембраны для аденозинтрифосфата (АТФ) и позволять ионам покидать цитоплазму. Механизм ингибирования оказался комбинацией вмешательства в активность ацилированного гомосеринлактон (AHL) и модуляции синтеза AHL. Ваттем и др.. (2007) результаты также показали, что различные фитохимические экстракты, которые ингибируют кворум-зондирование (QS), также ингибируют скопление патогенных бактерий, которое, как известно, модулируется QS. Наблюдение за тем, что фитохимические вещества из пищевых продуктов могут ингибировать процессы, связанные с QS, открывает захватывающую новую стратегию антимикробной химиотерапии и приводит к открытию новой категории антибиотиков, которые могут преодолеть проблемы, связанные с устойчивостью к противомикробным препаратам. В связи с этим считается, что эфирные масла как противомикробные средства имеют низкий риск развития резистентности патогенных микроорганизмов (Vattem et al. 2007; Aslim and Nihal 2008).

ВЫВОДЫ

Согласно нашим результатам, бактерицидный селективный эффект в отношении патогенных полезных бактерий Origanum ssp. И губаpia origanoides. Это исследование показало, что греческий вид орегано  (тип карвакрола, используется для производства продукта под торговой маркой Нпродукт) хорошо себя проявил против патогенных бактерий, но меньшую активность против полезных бактерий. Эти результаты показывают хороший потенциал этого вида для использования в качестве противомикробной добавки для здоровья животных и человека.

Сравнительная  таблица. Лабораторные исследования содержания основных фенолов.