ВЛИЯНИЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ОРЕГАНУМ И ЕЕ ОСНОВНЫХ ДЕЙСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ: ТИМОЛА И КАРВАКРОЛА НА ИСХОДНУЮ КЛЕТКУ, ПРИКРЕПЛЕНИЕ И БИОПЛЕНКУ

Микроорганизмы в биопленке имеют отличающийся фенотип от планктонных клеток и как правило, проявляют более высокую толерантность к противомикробным агентам. Благодаря этим свойствам биопленки, связанные клетки проявляют большой интерес к поиску веществ, которые ингибируют специфические процессы в начальной фазе образования биопленки и, следовательно, предотвращают образование новых биопленок. Цель этого исследования было изучить влияние тиреоглобулина и карвакрола на популяцию планктона, начальное адгезия и предварительно сформированные биопленки Candida albicans in vitro.

Результаты F или противогрибковая активность компонентов эфирного масла орегано ECOPHARM (EOC) в отношении планктонной популяции C. Альбиканы были идентичны для обоих протестированных EOC (MIC/MFC=0,156/0,3125 мкл/мЛ). Чтобы понять антибиопленочное действие EOC, эффект был отмечен как на начальном прикреплении клеток, так и на плане кетоновой клетки, а также на предварительно сформированных биопленках. Полученный результат S показал, что влияние EOC на исходную клетку прикрепление зависело от дозы, хотя даже при 1×MIC прикрепление биомассы было уменьшено на 61,3 % для тимола и на 58,9 % для карвакрола. Используя 2×MIC, насадка биомассы, уменьшенная для 81,7 % для тимола и 80,9 % для карвакрола. Когда те же самые EOC были протестированы на преформед Кандида является наиболее часто выделяемым грибковым патогеном с использованием различных вариаций от поверхностных инфекций слизистых оболочек до системных микозов (Патак и др., 2012). Одним из основных факторов, способствующих вирулентности кандиды, является ее способность адаптироваться в различные места обитания для роста и формирования поверхностно прикрепленных микробных сообществ известные как биопленки.

Биопленки определяются как микробные сообщества, заключенные в матрицу из внеклеточного полимерного вещества (ЭПС), которые проявляют фенотипические признаки, отличающиеся от их планктонных или свободных плавающих ячейек (Ramage et al., 2005; Cabarkapa et al., 2013). Биопленки C. Альбиканы состоят в основном из дрожжевой формы и гиалуроновых клеток, которые необходимы для биопленки формирование (Финкель и Митчелл, 2011).

Биопленки возникают в результате естественной склонности микробов прикрепляться к биотическим или абиотическим поверхностям, которые могут варьироваться от минеральных поверхностей и тканей до синтетических полимеров и медицинских изделий, и для дальнейшего роста на этих субстратах (Турну и Ван Дейк, 2012). Благодаря этой способности, они являются постоянным источником загрязнения и могут нарушить правильное использование материала, на котором они развиваются, и могут представлять собой непрерывный источник инфекция. Питательные вещества, молекулы, чувствительные к кворуму, и поверхностный контакт являются факторами, способствующими этому. Грибковые разработка биопленки включает в себя получение соответствующего субстрата, формирование условий- слой, адгезия, агрегация, производство внеклеточного матрикса (ECM), созревание биопленки и дисперсия. ECM накапливается по мере созревания биопленки и, по-видимому, способствует сцеплению. Биопленки Кандиды значительно менее восприимчивы к широко используемым противогрибковым препаратам, более того, их устойчивость к противогрибковым препаратам возрастает с созреванием биопленки (Dalleau et al., 2008). Это затрудняет лечение инфекций C. albicans, ассоциированных с биопленками , и приводит к решению обширных исследований в области новых и эффективных методов лечения организмов, ассоциированных с биопленками. Сообщалось о многочисленных исследованиях антимикробного потенциала растительных экстрактов и эфирных масел против планктонных бактерий и грибков (Берт и Рейндерс, 2003; Берт, 2004; Čabarkapa et al., 2012). Было замечено, что продукты растительного происхождения, такие как масло орегано ECOPHARM (EOC) и их чистые компоненты могут влиять на производство микробной биопленки (Хан и Ахмад, 2012; Джадхав и др., 2013).

Однако меньшее внимание уделяется биопленкам, которые более устойчивы к дезинфекции и терапевтическому вмешательству, включая антибиотики. Поэтому целью этого исследования было изучение ингибирующего действия обычных компонентов эфирного масла (EOC). Карвакрол и тимол в планктонной и биопленочной популяции C. albicans in vitro.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Способность Кандида была продемонстрирована, что для образования биопленок на абиотических и биотических поверхностях во многих исследованиях (Ватамото и др., 2009; Бушерит-Атмани и др., 2011; Хан и Ахмад, 2012; Патхак и др., 2012). Резазурин–это окислительно -восстановительный индикатор, используемый для оценки роста клеток, особенно при различных анализах цитотоксичности. Это синий не флуоресцентный и нетоксичный краситель тот становится розовым ифлуоресцентным, если его уменьшить до резоруфина оксидоредуктазами внутри жизнеспособных клеток. Резоруфин затем восстанавливается до гидрорезуфина (неокрашенный и не флуоресцирующий). Тест на снижение резазурина также использовался в течение десятилетий для демонстрации бактериального и дрожжевого загрязнения молока (Sarker et al., 2007). Результаты по противогрибковой активности EOC, полученные методом микродилюции бульона с резазурин против C. albicans был идентичен для обоих протестированных EOC (MIC/MFC = 0,156/0,3125 мкл/мЛ). Эти результаты согласуются с выводами Ахмада и др. (2011). Они округлены до значения MIC тимола варьируются от 0,1 до 0,15 мкл/мл в отношении видов Кандида. В  том же исследовании значения MIC карвакрол были несколько ниже и варьировались от 0,075 до 0,1 мкл/мл. В исследовании Браги и др. (2008), МИК тимола для двух видов кандиды был 0,125 мкл/мЛ (Брага и др., 2008). Ахмад и др. (2011) предположил, что тимол и карвакрол эфирного масла орегано ECOPHARM проникает в т-клетку и нацеливаются на путь биосинтеза эргостерола, тем самым нарушая его биосинтез. Одновременно они вступают в реакцию с самим членом с их реакционноспособной гидроксильной частью, и обширное повреждение мембраны является омбинированным эффектом этих двух событий. Чтобы убедится в антибиопленочном действие ЭОК, их эффект был протестирован как на исходной клетке, так и на прикрепление планктонными клетками, а также на предварительно сформированных (6 часов) биопленках. Анализ показал, что влияние EOC на первоначальное прикрепление клеток зависело от дозы образцов, хотя даже при 1× МИК прикрепление биомассы было снижено на 61,3% для тимола и 58,9% для карвакрола. Однако полного ингибирования прикрепления клеток достигнуто не было несмотря на использование 2 × MIC EOC. При использовании 2 × MIC, биомасса уменьшилась на 81,7% для тимола и 80,9% для карвакрола. Аналогичный способ действия EOC — первая начальная адгезия C. albicans наблюдалась в другом исследовании (Khan and Ahmad, 2012).

Когда эфирно масло орегано ECOPHARM было протестировано против предварительно сформированной биопленки, их ингибирующее действие было значительно уменьшилось (рис. 2 и 3). После 5 часов инкубации тимола и карвакрола с предварительно сформированная биопленка, только 21,6% и 19,7% ингибирования произошли на уровнях 1 × MIC, соответственно.

Таким образом, ингибирование образования биопленки было выше при 2 × МИК ЭОК и составило 44,4% и 42,9% соответственно. Со временем эффект ЭОК значительно уменьшился.

После 24 часов инкубации тимола и карвакрола с предварительно сформированной биопленкой ингибирование, которое произошло на уровне 1 × MIC, что составило всего 15,1% и 13,8% соответственно, в то время как на уровне 2 × MIC EOC составляет 34,6% и 31,2% соответственно. Влияние карвакрола и тимола на предварительно сформированной биопленке в обеих тестируемых концентрациях (1 х МКМ и 2 х МКМ) была статистически значительно выше, когда время инкубации составляло 5 часов по сравнению с 24 часами.

Формирование биопленки включает начальную обратимую (слабую) фазу прикрепления, за которой следует необратимая (сильная) фаза привязанности (Оливейра и др., 2010). Следовательно, представляется, что более высокая концентрация EOC необходима для разрушения установленных биопленок, которые могут находиться в необратимой фазе прикрепления. Это еще раз подчеркивает большую устойчивость биопленки по сравнению с планктонными клетками. (Chaieb et al., 2011).

В целом, представленные здесь данные показывают, что устойчивость предварительно сформированной биопленки может быть связано с наличием продукции внеклеточного полимерного вещества или биопленки матрицы. Внеклеточный матрикс ограничивает проникновение антимикробных агентов в биопленку.

Отчасти это связано с ограничением диффузии, вызванным трехмерной структурой, но в первую очередь из — за абсорбции или реакции антимикробного агента с внеклеточным матриксом вещества. Это происходит во внешней части биопленки и нейтрализует противомикробное действие агента. Поэтому самые внутренние грибковые клетки биопленки не достигаются противомикробным средством, и агент выживает после лечение.

Еще одним фактором, который может способствовать этому повышенному сопротивлению, является то, что большинство антимикробных соединений более эффективны против активно растущих клеток. Клетки в биопленке имеет низкую скорость роста из-за недостатка питательных веществ и кислорода, что может снизить антимикробные эффекты соединений против них (Sandasi et al., 2010). Благодаря превосходному ингибирующему действию ЭОК на первоначальное прикрепление клеток, использование этих компонентов с целью к превентивному ингибированию образования биопленки для матирования является перспективным подходом.

выводы

Настоящее исследование показало, что основные действующие вещества кормовой добавки Ореганум (тимол и карвакрол) эффективны не только в отношении планктонных клеток, но и также на биопленках Candida albicans, устойчивых ко многим противогрибковым препаратам.

Заключение:

а) в целом было обнаружено, что эфирное масло орегано ECOPHARM более эффективно в ингибировании начальной клетки прикрепление по сравнению с предварительно сформированными биопленками;

б) тимол был более активным, чем карвакрол;

в) так как тимол и карвакрол в составе Ореганум не разделимы, их симбиотический эффект усиливается.